恶性肿瘤免疫治疗的耐药机制

来源

肿瘤学杂志 2018 年第24 卷第11 期

作者

刘瑾，蒋海萍，俞雄飞，徐农

浙江大学医学院附属第一医院

摘要

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint blockade，ICB）的发现及应用在恶性肿瘤治疗上取得了重大进展，现已有多种ICB 应用于临床，包括抗细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4 （cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4） 单抗、抗程序性细胞死亡受体1（programmedcell death-1，PD-1）及其配体PD-L1（programmed cell death-ligand1）单抗等。

但是并非所有患者都能获益，ICB 治疗有效的患者会发生耐药，部分患者初治就对ICB 不敏感。

因此，揭示ICB 的耐药机制及如何克服耐药显得至关重要。全文就已发现的ICB 耐药机制及克服耐药的多种联合治疗模式进行综述，为临床研究及临床实践提供新思路。

关键词

肿瘤；免疫治疗；免疫检查点抑制剂；耐药

免疫检查点是免疫细胞调节和控制免疫应答，同时保持自我耐受的信号通路分子， 包括刺激性及抑制性分子， 目前认为抑制性分子是肿瘤免疫治疗的有效靶点。以抑制性免疫检查点为靶点的免疫治疗使肿瘤治疗的重点从肿瘤细胞本身转移到宿主的免疫系统，调动免疫细胞识别并最终消除肿瘤细胞［1］。

目前，针对抑制性分子CTLA-4、PD-1 及PD-L1 的免疫治疗在许多临床试验上取得了明显疗效， 并且随着美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）批准CTLA-4 抑制剂伊匹单抗（Ipilimumab）用于晚期黑色素瘤的治疗，PD-1 抑制剂纳武单抗（Nivolumab）、派姆单抗（Pembrolizumab）等用于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、肾癌、转移性黑色素瘤的治疗［2］，以抗CTLA-4、抗PD-1/PD-L1 为代表的免疫治疗已成为继细胞毒化疗、靶向治疗之外的第三种全身治疗方法。

但是，免疫耐药问题也随之出现， 一些患者初始对免疫治疗就无应答， 而对免疫治疗有效的患者一段时间后也会发生病情进展或复发。因此，阐明免疫耐药机制并克服免疫耐药至关重要。

免疫检查点抑制剂（immunecheckpoint blockade，ICB） 耐药可分为：

（1）原发性耐药：肿瘤对免疫治疗初始就无反应。

（2）适应性耐药：肿瘤能够被免疫系统识别，但其通过适应免疫逃脱免疫杀伤。在临床上可表现为原发性耐药、混合耐药或继发性耐药。

（3）继发性耐药：肿瘤对免疫治疗初始有反应，但在治疗一段时间后进展或复发。全文就免疫耐药的机制作一综述。

1

原发性耐药

1.1 肿瘤内在因素

1.1.1 肿瘤免疫原性抗

PD-1 治疗有效的前提是肿瘤特异性抗原能够被T 细胞识别。

目前认为肿瘤突变负荷（tumormutation burden，TMB）越高，产生的新抗原越多，肿瘤免疫原性越强，T 细胞反应及抗肿瘤反应越强［3］。

临床上，高TMB 的黑色素瘤、肾细胞癌、NSCLC 对抗PD-1 治疗的疗效更好， 而低TMB 的胰腺癌及前列腺癌则较差［4，5］。

因此，非同义突变产生的肿瘤新抗原对肿瘤特异性免疫敏感性至关重要， 可能与免疫耐药相关［5~7］。

Hippo 信号通路（hippo signalingpathway，HSP） 可调节细胞增殖和凋亡，LATS1/2 是HSP 激酶，其激活在HSP 中起关键作用。

Moroishi 等［8］发现，LATS1/2 表达缺失可促进富含核酸的细胞外囊泡分泌， 增强肿瘤免疫原性及炎性细胞浸润。

因此，抑制LATS1/2 可通过增加肿瘤免疫原性来克服免疫耐药。

1.1.2 信号通路

改变肿瘤细胞内在的信号通路通过产生免疫抑制因子，或改变一些基因表达来影响ICB 疗效。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 通路产生血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF） 与白介素8 （interleukin-8，IL-8），抑制T 细胞的招募及功能［9］。

抑癌基因PTEN 的表达缺失使PI3K 通路增强，并抑制干扰素γ（interferon-gamma，IFN-γ)信号通路及肿瘤抗原表达，与肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）减少呈正相关，促进免疫耐药［10］。

IFN-γ可增强主要组织相容性复合体（major histocompatibilitycomplex，MHC）分子的表达从而增强肿瘤抗原递呈， 也能招募其他免疫细胞或直接抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。

因此肿瘤细胞上IFN-γ 通路相关蛋白， 如IFN-γ 受体链JAK1、JAK2、STATs 及IRF1 等突变与缺失，都会导致ICB 耐药［11］。

1.2 肿瘤外在因素

1.2.1 抗原递呈细胞及效应

T 细胞抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）如树突状细胞（dendritic cell，DC） 可启动活化效应T细胞，T 细胞在肿瘤抗原的刺激下，激活外周淋巴结中的DC，到达并浸润肿瘤组织，识别杀伤肿瘤细胞［12］。

因此影响抗原递呈及T 细胞活化过程均可致ICB耐药。

免疫刺激分子CD40、CD137 抑制剂能改善DC 的效应功能，在动物实验中联合抗PD-1 具有良好的抗肿瘤增敏效应［13］。

Talimogene laherparepvec（T-VEC） 是一种工程化的溶瘤单纯疱疹1 型病毒，可选择性地在肿瘤内复制，产生粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以增强系统性抗肿瘤免疫反应。体内实验证实T-VEC 可增强APC 活性，改善抗PD-1 耐药［14］，已被批准用于晚期不可切除黑色素瘤的治疗［15］。

Spranger 等［16］ 发现β-catenin 信号通路突变引起CCL4 表达降低，导致TIL 浸润不良，影响免疫应答，而BRAF 抑制剂联合MEK 抑制剂能增强肿瘤组织中CD8+、CD4+、PD-1+淋巴细胞浸润， 在BRAF 突变型转移性黑色素瘤中具有抗肿瘤增敏效应［17］。

1.2.2 记忆T 细胞

研究指出记忆T 细胞可能在免疫治疗中发挥积极抗肿瘤作用。

Ribas 等［18］发现CD8+ T 记忆细胞是抗PD-1 治疗敏感患者中扩增的主要T 细胞亚群，而在治疗反应差的患者中数量极少， 提示诱导记忆T 细胞形成可能提高抗PD-1 治疗敏感性。

因此，阐明CD8+ T 记忆细胞记忆形成与维持的机制意义重大。

Ma 等［19］采用IL-15 体外诱导CD8+记忆性T 细胞模型和过继OT-1 T 细胞的小鼠感染Lm-OVA 的体内模型， 发现糖异生-糖原代谢-磷酸戊糖途径是CD8+ T 细胞记忆形成与维持的关键机制，更多的机制需要将来进一步探索。

1.2.3 免疫抑制性细胞及分子

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的免疫抑制性成分， 如调节性T 细胞（regulatory Tcells，Tregs）、髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressorcell，MDSC）、肿瘤生长因子β（tumor growthfactor-β，TGF-β）、M2 型肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophage，TAM)等通过不同机制影响免疫应答。

Tregs、VEGF 通过分泌抑制性细胞因子IL-10、降低MHC Ⅱ类分子表达、影响DC 成熟而抑制免疫应答［20］。

MDSC 可表达CD11b+与CD33+，促进血管生长、肿瘤侵袭及转移，且CXCR2 可诱导MDSC浸入肿瘤，介导免疫耐药［21］。

M2 型TAM 分泌IL-10及TGF-β，TGF-β 能够促进血管生成， 并促进Tregs免疫抑制作用［22］。

1.2.4 免疫代谢变化

免疫细胞的代谢状态在免疫应答时发生复杂变化，其代谢紊乱可能导致ICB 耐药。

吲哚胺2，3-双加氧酶1 （indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO1） 是将色氨酸降解为犬尿氨酸的限速酶，上调犬尿氨酸，增强Tregs 及MDSC 的免疫抑制功能，导致抗PD-1 耐药［23］。

IDO1 和PD-L1 可同时表达于多种肿瘤，在介导效应T 细胞抑制方面起互补作用［24，25］，因此IDO1抑制剂联合PD-L1 抑制剂可减轻免疫抑制。

生理状态下缺氧、局部缺血可促进免疫抑制性腺苷生成，其不仅结合CD8+ T 细胞上的A2A 受体， 抑制T 细胞增殖及细胞毒活性，也能结合肿瘤细胞上的A2B 受体促进肿瘤转移［26］。

Allard 等［27］发现活化腺苷通路可增强CD8+ T 细胞上PD-1 表达， 从而促进T 细胞耗竭，导致抗PD-1 耐药。

在动物实验中，A2A 受体抑制剂联合PD-1 抑制剂抗肿瘤转移增敏效应显著［28］，该联合方案有望在临床中探索。

1.3 其他因素

1.3.1 肠道微生物

动物实验及人体试验的结果表明， 肠道微生物可影响免疫治疗疗效，且与ICB 耐药有关。

Vetizou等［29］发现通过调节老鼠的肠道微生物，可改善抗CTLA-4 疗效。

近期又有研究发现，ICB 治疗有效和无效患者拥有的肠道微生物明显不同， 且免疫治疗前口服抗生素的患者， 总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression free survival，PFS）均显著性缩短。

同时将ICB 治疗有效患者的肠道微生物移植到无菌小鼠身上，发现初始对ICB 缺乏响应的荷瘤小鼠发生肿瘤退缩［30，31］。

Gopalakrishnan 等［32］研究也得出了类似的结果， 这可能与不同微生物能够影响肠道内氨基酸的合成、增强抗原递呈及改善效应T 细胞的功能有关。

这些研究结果提示，在ICB的临床应用中应限制或密切监控抗生素的使用，特殊菌群移植存在临床获益。

1.3.2 遗传机制

遗传机制改变可能与免疫治疗响应相关。Snyder等［33］发现黑色素瘤和NSCLC 患者接受ICB 治疗的临床获益与高TMB 呈正相关，而TMB 相似时，人类淋巴细胞抗原Ⅰ （human lymphocyte antigen，HLA Ⅰ）多样性更丰富的患者ICB 治疗疗效更好［34］。

美国Dana-Farber 癌症研究所应用全外显子组DNA 测序，发现ICB 治疗有效的肿瘤患者缺乏一种功能性PRBM1基因［35］。

Pan 等［36］利用CRISPR/Cas9 技术对黑色素瘤细胞的基因组进行分析， 也发现PBRM1、ARID2和BRD7 与肿瘤细胞抵抗T 细胞杀伤有关。

PRBM1基因编码BAF180 蛋白， 该蛋白是SWI/SNF 染色质重塑复合体PBAF 亚型的一个亚基， 其功能丧失增加了肿瘤细胞对IFN-γ 的敏感性， 导致募集效应T细胞的趋化因子分泌增加，增强了对ICB 的响应。

2

继发性耐药

2.1 肿瘤

内在因素在某些情况下，抗原加工过程中的蛋白酶体、转运蛋白、MHC 及B2M 的功能缺陷，会导致肿瘤抗原无法被有效递呈至细胞表面。

B2M 在MHC-Ⅰ分子的折叠及转运至细胞膜的过程中发挥关键作用，其功能丧失导致T 细胞识别功能缺陷，最终导致肿瘤转移及免疫耐药［37，38］。

Zaretsky 等［39］发现在接受抗PD-1 治疗后复发的黑色素瘤患者中存在B2M 基因突变，这进一步说明B2M 缺失与ICB 继发性耐药相关。

同时发现， 黑色素瘤复发患者的肿瘤标本存在JAK1、JAK2 基因突变， 且伴有JAK1 或JAK2 的纯合性缺失， 提示JAK1、JAK2 基因突变与抗PD-1 继发性耐药相关［40］。

2.2 肿瘤外在因素

2.2.1 免疫共抑制受体继发性过表达

除PD-1 外，T 细胞上表达的其他免疫共抑制受体继发性过表达可能导致ICB 继发性耐药。

研究发现，在EGFR、KRAS 突变的肺腺癌小鼠抗PD-1 治疗耐药后，CD4+/CD8+ T 细胞比例显著性下降，TIM3 表达显著性上调， 而予以TIM3 阻断治疗后小鼠的存活时间显著性延长；肺癌患者抗PD-1 治疗进展后，胸水中也找到高表达TIM3 的T 细胞［41］，进一步证实TIM3 高表达与抗PD-1 耐药相关。

Thommen 等［42］也发现，TIM3、LAG3、CTLA4 及BTLA 和PD-1 的共表达与NSCLC 抗PD-1 耐药相关， 但是这些受体能否独立表达于T 细胞尚不明了。

2.2.2 T 细胞耗竭

肿瘤抗原持续存在可导致T 细胞耗竭，且与多种抑制性受体，如PD-1、LAG-3、TIM-3、CD160、TIGIT等高表达有关，严重的T 细胞耗竭导致继发性免疫耐药［43~46］。

CD28 作为T 细胞的共刺激分子，对其激活、增殖及存活起到关键作用。

在动物实验中阻断CD28-B7 共刺激通路后，肿瘤特异性CD8+ T 细胞的增殖和激活受到影响；在接受抗PD-1 治疗的NSCLC 患者中，增殖的CD8+ T 细胞多为CD28 阳性，这与动物实验中结果一致， 提示CD28 共刺激对于PD-1+的CD8+ T 细胞的增殖与再激活至关重要［47］。

因此，CD28 可能作为预测PD-1 抗体疗效的分子标记。

3

耐药监测

耐药监测有赖于肿瘤组织、血液及其他生物样本的基线及动态分析［1］。

基线评估是在患者接受ICB治疗前对肿瘤突变负荷、驱动突变、基因表达、免疫谱（包括CD8+ T 细胞分析，PD-L1 表达和T 细胞克隆性）等进行分析，动态分析是在治疗早期、肿瘤进展时对患者的肿瘤组织、血液及微生物组进行分析。在当前的临床工作中， 检测外周血及再次活检逐渐成为常用的手段， 未来仍需要探索最佳检测标本及检测时机，并且加强耐药监测，早期发现耐药，探索耐药机制， 为肿瘤患者制定更加精准的个体化免疫治疗方案。

4

克服免疫耐药

目前主要针对相应的耐药机制， 采取对应的措施，比如增强肿瘤免疫原性、降低抑制性细胞及分子的活性、增强TILs 浸润、抑制免疫共抑制受体表达等。

由于单药治疗过程中不可避免的耐药， 联合用药成为当前研究的热点。

4.1 联合放化疗

以往观念认为化疗可通过影响淋巴细胞数量或其功能导致免疫抑制，但深入研究发现，某些化疗药物可增强肿瘤免疫原性［48］。

体内药代动力学研究表明， 脂质体多柔比星可降低TME 中Tregs 比例，联合抗PD-L1 还可增加CD8+ T 细胞浸润。

在动物实验中， 脂质体多柔比星联合免疫疗法可产生协同抗肿瘤作用，且更多的小鼠获得肿瘤完全缓解，生存期也延长［49］。

放疗可调节肿瘤表型，增强抗原递呈和肿瘤免疫原性，增加趋化因子释放和招募效应T 细胞至TME 中，发挥协同免疫抗肿瘤作用［50，51］。

临床资料显示， 免疫联合立体定向放疗（immunotherapy +stereotactic ablative radiotherapy，ISABR）显著性改善晚期黑色素瘤患者的生存。目前，已有多项放疗联合免疫治疗的临床试验正在进行中［51］。

4.2 联合靶向治疗靶向治疗

不仅可以杀死肿瘤细胞， 还能在肿瘤细胞、宿主免疫系统和TME 中诱导免疫效应，联合免疫治疗具有协同抗癌作用［52］。

派姆单抗联合BRAF 抑制剂在小鼠黑色素瘤中具有协同抗肿瘤活性，且能够延长转移性黑色素瘤小鼠的应答时间［53］。

近年来， 靶向治疗联合免疫治疗的临床试验不再局限于传统的“免疫疗法敏感”的肾癌或黑色素瘤，在多种肿瘤中广泛开展， 但是多项研究都因联合用药的毒副反应增加而宣告失败［52］。

未来需要更多的尝试及探索。

4.3 联合多种ICB

临床前研究结果表明， 抗PD-1 联合抗CTLA-4及抗OX40 可选择性剔除Tregs ［54，55］， 联合抗TIM3及抗TIGIT 也能抑制Tregs 活性， 且抗TIM3 及抗LAG3 联合抗PD-1 疗法在临床前研究中抗肿瘤增敏效果显著［56］，但是这些靶向疗法目前还处于基础研究阶段，尚未进入临床试验。

一项Ⅰ期研究结果表明， 伊匹单抗联合纳武单抗治疗晚期黑色素瘤对比单药治疗， 客观缓解率（objective response rate，ORR）明显提高，尽管3~4 级不良反应发生率较高，但通常可逆［57］。

Ⅲ期研究结果表明，晚期黑色素瘤患者接受纳武单抗联合伊匹单抗治疗， 对比单药纳武单抗或伊匹单抗，PFS、OS 及ORR 均明显提高［58］。

目前， 虽然联合免疫治疗的最佳时机及顺序还未有明确定论，但越来越多的证据表明，得益于不同免疫疗法耐药机制的不同， 一种免疫疗法失败后的肿瘤可对另一种ICB 做出应答［59］。

联合免疫疗法有望成为克服免疫耐药的新选择。免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗领域取得了突破性的进展， 但是免疫耐药仍然使许多患者无法从ICB 治疗中获益。

因此，如何确定预测免疫疗效的生物标志物，如何在肿瘤治疗期间精确监测耐药，如何识别耐药机制， 以及如何制定最佳的联合策略克服免疫耐药， 乃至如何选择临床获益人群仍是免疫治疗面临的挑战。