类器官——培养、科学研究与药物筛选

尽管动物模型可以回答一些生物学问题,但是太复杂,无法直接回答细胞间相互作用。此外,人体和动物之间的物种差别,使得动物实验只能作为一个参考,在转化至人体时,通常会发现差别。

类器官是2017年Nature Methods评选的年度方法, 细胞可来源于人体,结构类似于器官,则可以作为接近人体的研究模型, 进行科学研究和药物筛选。(喵评)

类器官的培养

成人干细胞衍生的类器官培养,通常是通过将分离的成人干细胞或所需器官培养的单细胞悬浮液,嵌入到细胞外基质(ECM)水凝胶中来建立的。例如肠道器官,从小肠或结肠分离出的隐窝细胞足以培养出类器官,也可以从分离的成人肠干细胞中培养出类器官。

上皮类器官培养基是以附加与器官相关的生长因子的培养基为基础的。

因此,从其他组织(如呼吸道、肝脏、胰腺、皮肤、膀胱、大脑、心脏)提取的细胞器要求在培养中补充相关生长因子。

大脑类器官培养过程如下图:诱导多能干细胞(iPSC)衍生细胞在神经诱导介质中生长,产生神经外胚层,嵌入Matrigel中,并在旋转生物反应器或轨道摇床中生长,以更好地扩散,获得三维脑器官。在暴露于维甲酸的情况下,大脑器官通过自我组装模式,形成自缔和组织,形成包括放射状胶质细胞在内的不同种群的神经祖细胞,这些神经祖细胞扩展形成大脑结构。

大脑类器官培养过程

科学研究举例

上皮类器官研究上皮细胞-免疫细胞相互作用

上皮细胞出现在机体所有和外界接触的边界,比如皮肤,呼吸道,肺,消化道,是机体对抗病原体侵染的第一层屏障,也是第一个对病原性感染作出反应的细胞。为了维持体内平衡,并提供对感染的快速反应,上皮细胞与免疫细胞密切配合。所以在上皮区域,也是全身免疫细胞浓度最高的区域。

建立上皮细胞和免疫细胞相互作用的模型,是研究抗感染免疫和损伤后免疫的重要手段。

上皮细胞类器官的建立,可以非常精准的模拟机体上皮环境,也被发展起来研究上皮和免疫细胞相互作用。

有三种共培养的模式

用存在于细胞外基质中的重组细胞因子处理类器官,评价免疫细胞衍生细胞因子对于上皮细胞的影响。如IL-4和IL-13促进丛生细胞分化,而IL-22支持干细胞增殖和存活。

将器官消化到单个细胞,然后在免疫细胞存在的情况下,再生长。用于评估免疫细胞和免疫细胞衍生的细胞因子(可溶性或膜结合)对器官生长和分化的影响,以及上皮细胞对免疫细胞表型的影响。

在ECM或生长培养基(悬浮培养)中,向完整的类器官中添加(活化的)免疫细胞,如T细胞或固有淋巴样细胞(ILCs),以评估免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。这些检测的读数通常包含消化形成的器官和随后的转录(无论是(单细胞)RNA测序或定量PCR(Q PCR),成像和/或流式细胞术评估上皮细胞和/或免疫细胞表型。在这些共培养中使用的免疫细胞要么直接从小鼠组织(例如,脾细胞、肠上皮内淋巴细胞、固有层T细胞、固有层ILCs或肺ILC2s)中分类,要么直接从人外周血中提取,要么先在体外分化。

胸腺类器官研究T细胞发育

胸腺是T细胞成熟和从祖细胞向成熟的幼稚淋巴细胞分化的中心部位。来源于骨髓的T细胞祖细胞在胸腺皮质进行阳性选择,随后在胸腺髓质中进行阴性选择。胸腺的这些区域由两种不同的上皮细胞组成:皮质胸腺上皮细胞(CTECs)和髓质胸腺上皮细胞(MTECs)。

3D重建胸腺被证明是模拟其功能的关键,几种胸腺类器官的产生方法:这些器官培养通常是从人类身上建立起来的或胎鼠或新生儿胸腺组织,但也有报道称TEC样细胞与人胚胎干细胞的体外分化,这些培养都产生胸腺样结构。在体外产生活的T细胞,并在移植到裸鼠上时发挥作用。有趣的是,虽然长时间的类似胸腺的培养是可能的(离体培养长达56天),但细胞在连续传代时失去了集落形成能力。重要的是,虽然在成年小鼠中已经发现了一种双能的TEC前体,但含cTECs和mTECs的胸腺器官尚未从单个干细胞中生成。此外,考虑到小鼠体内某些双能TEC前体的生长因子已被发现(例如BMP 4和IL-22),可以尝试这些因子是否可用于维持TEC的祖细胞来源的类器官。

病原微生物感染

幽门螺杆菌(一种革兰氏阴性细菌,是胃溃疡的致病菌),经被微量注射到人的iPSC来源的胃类器官,在那里它与上皮紧密相连,并随后转移毒力因子细胞毒素相关基因A(CAGA)进入上皮细胞。幽门螺杆菌诱导iPSC衍生的胃器官中表达检查点PDL1,可能导致免疫逃逸。实际上,在没有PD1阻断抗体的情况下,自体细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对类器官没有任何作用。因而类器官不但可以模拟感染的病理过程,也可以作为模型进行药物作用机理研究。

类器官模型也被用于艰难梭菌感染肠道上皮细胞,呼吸道合胞病毒感染肺上皮细胞等的研究。

组织修复和再生

免疫系统也参与上皮损伤后的组织修复。例如,ILC3衍生的IL-22保护肠道免受辐射、化疗或移植物抗宿主病的损害。如上所述,IL-22独立于其他因素和Paneth细胞的存在,诱导LGR5 ISCs的存活和增殖。

发现促炎细胞因子TNF,而不是IL-6,以NF-κB依赖的方式促进原代小鼠肝细胞类器官的长期培养。重要的是,小鼠和人的类器官都可以在没有TNF的情况下生长,这表明虽然低度炎症是上皮再生所必需的,但在稳态条件下不需要.

类器官为损伤修复及再生提供了类似于机体环境的模型。

肿瘤微环境

两种主要的方式被使用(以非小细胞肺癌为例)

在整体方法(左)中,肿瘤活检组织是在气液界面间环境培养,所有肿瘤细胞类型的细胞悬液,包括内源性免疫细胞和其他非上皮细胞类型,促进肿瘤特异性T细胞的生长。

在还原模拟方法(右)中,上皮类器官是从肿瘤活检组织中生长出来的,然后与来自同一患者外周血的自体免疫细胞共培养,以促进肿瘤反应细胞的连续扩张。

虽然整体方法允许包括整个肿瘤微环境的肿瘤材料的培养,因此与体内情况非常相似,但不易长时间维持,而还原模拟方法允许肿瘤上皮的长期培养和扩展,这使得更广泛,更长期的研究成为可能。

药物筛选举例

促进心肌纤维细胞生长化合物筛选(文献3 Cell Stem Cell)

动物模型,主要是老鼠,被广泛用于研究心脏病,提供有价值的结果。然而,由于许多功能和生物学特性的物种差异很大,它们对人类心脏疾病和药物安全性的推断很差。

人类多能干细胞(hPSC)可以为生物医学和药物研究提供无限的人类心肌细胞来源,有可能弥合这一鸿沟。

然而,传统2D培养中的hPSC源性心肌细胞缺乏功能成熟,,这在某些情况下阻碍了它们准确预测人类生物学和病理生理学的能力。多细胞3D人体类器官提供了更精确的模型,是解决这一问题的潜在方法。

澳大利亚昆士兰大学生物医学系的科学家在Cell Stem Cell发表文章,阐述他们基于96孔板,培养心脏心肌类器官,进而进行化合物筛选的新流程。

具体流程如下图

基于类器官,将5000种化合物,筛选出不同功能化合物。

特定神经类器官培养及药物筛选等应用(文献2)

首先神经球在不同分化培养基种培养(具体的诱导因子及生长因子见下图),产生大脑,中脑,海马,前脑等不同脑部类器官。

神经类器官的各种应用

物种进化

先天性脑畸形

神经退行性疾病

基因编辑

药物筛选

疾病病理学研究

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